Документирующие системы ODYSSEY, LI-COR

Введение

Документирующие системы Odyssey, LI-COR

В течение многих лет для получения изображений Вестерн-блотов применялась хемилюминесценция в сочетании с пленочной технологией детекции. Однако, при всех достоинствах, данный подход обладает целым рядом существенных недостатков:

1. Требуется отдельная, специально оборудованная, фотографическая лаборатория;
2. Требуются дорогостоящие реагенты для проявки и фотографические пластины;
3. Отдельные затраты на утилизацию токсичных реагентов, применяемых при проявке фотографических пластин;
4. В большинстве случаев, для детекции сигналов различной интенсивности, требуются многократные экспозиции;
5. Процедуры проявки длительные и крайне трудоемкие;
6. Узкий динамический диапазон и, как следствие, проблемы с пересыщением и угасанием полос;
7. Количественный анализ результатов крайне затруднен, практически невозможен.

Между тем, требования научных журналов к отчетности и воспроизводимости результатов непрерывно растут.

Сравнительно недавно, на смену пленке пришли цифровые методы детекции, что позволило существенно расширить динамический диапазон метода и, до некоторой степени, упростило процедуру количественной оценки результатов.

Рис.1 - Динамический диапазон фотопленки – 1 порядок, динамический диапазон большинства современных цифровых имаджиров – 2-3 порядка, динамический диапазон систем серии Odyssey – более 6 порядков. Столь широкий динамический диапазон позволяет за одну экспозицию с одинаковой четкостью детектировать как очень сильные, так и очень слабые сигналы. Отпадают проблемы засвечивания более слабых сигналов – более сильными и эффекты насыщения.

Однако хемилюминесценция, в виду того, что является ферментативной реакцией, не позволяет произвести истинного количественного анализа данных; а полуколичественный анализ, с применением данной технологии, требует длительной и сложной процедуры построения калибровочной кривой.

В течение последних 10 лет вместо хемилюминесценции все чаще стала применяться флуоресценция.

1. Флуоресценция не является ферментативной реакцией и в меньшей степени зависит от условий окружающей среды.
2. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна концентрации мишени, что дает возможность произвести истинный количественный анализ.
3. Не требуются продолжительные экспозиции.

Рис. 2 - HRP-ферментативная реакция против флуоресценции.

Венцом данного подхода стала технология инфракрасной (ИК) флуоресцентной детекции Вестерн-блотов, предложенная специалистами компании LI-COR Biosciences (США).

Эта технология сегодня является «золотым стандартом» для количественной обработки Вестерн-блотов.

Семейство ODYSSEY включает в себя следующие модели:

• Odyssey CLx – наиболее многофункциональная и чувствительная система
• Odyssey Fc – гибридная система с возможностью ИК-флуоресцентной и традиционной - хемилюминесцентной детекции.

Основные преимущества систем формирования изображений ODYSSEY:

• Высокоточная, быстрая, простая качественная и количественная обработка Вестерн-блотов с отлично воспроизводимыми результатами. Запись и обработка изображений может производиться как в ручном, так и в автоматическом режиме. Автоматический режим позволяет вам получить высококачественные и воспроизводимые результаты нажатием всего одной кнопки.

• Во всех системах LI-COR Biosciences (США), работающих на принципе детекции ИК-флуоресценции, для возбуждения флуоресцентного сигнала используются твердотельные лазерные диоды. Использование лазера позволило отказаться от сложной системы светофильтров, существенно повысить интенсивность сигнала, а также позволило достичь максимально четкого расхождения спектров возбуждения и эмиссии. Как следствие, существенно повысилась разрешающая способность систем.

Рис. 3 - Преимущества использования лазера для возбуждения флуоресценции.

• Системы LI-COR Biosciences (США) работают в диапазоне ближнего ИК-спектра 680 - 820 нм, в пределах которого показатели поглощения, автофлуоресценции и светорассеяния для воды, большей части биологических объектов, а также пластиков и мембран – минимальны. Это понижает интенсивность фонового сигнала и повышает разрешающую способность системы.

Рис. 4 - В диапазоне длин волн 680 - 820 нм показатели поглощения, автофлуоресценции и светорассеяния для воды, большей части биологических объектов, а также пластиков и мембран – минимальны.

• Возбуждение и детекция флуоресценции идут параллельно по двум независимым каналам (700 и 800 нм), что позволяет одновременно детектировать несколько (до 3-х) мишеней в одном образце. Сигналы не перекрываются и не оказывают влияния друг на друга.

• Широкий динамический диапазон (до 6 порядков) и высокое разрешение позволяют детектировать как очень сильные, так и очень слабые сигналы за один раунд. Нет необходимости во множественных экспозициях.

• Все это, наряду с передовым программным обеспечением Image Studio позволяет добиться поистине феноменальной четкости изображений и точности их количественного анализа.

• Помимо документации вестерн-блотов, системы LI-COR Biosciences (США) серии Odyssey имеют очень широкий спектр других применений (см. ниже).
• Вы экономите свои средства:
  • Нет затрат на проявочные реагенты и фотографические пластины;
  • Не требуется тратить средства и пространство на содержание фотографической лаборатории;
  • Нет затрат на утилизацию токсичных реагентов.
• Вы экономите свое время:
  • Системы LI-COR Biosciences (США) серии Odyssey полностью настроены и готовы к использованию. Вам не обязательно вникать в подробности функционирования и тратить время на подбор параметров глубины фокуса и длины экспозиции. Автоматический режим детекции позволяет получить изображения идеального качества нажатием всего одной клавиши.
  • Системы LI-COR Biosciences (США) серии Odyssey позволяют детектировать несколько мишеней одновременно (до 3х на одной мембране). Следовательно, вы экономите время, которое ранее ушло бы на отмывку и повторную гибридизацию образцов.
  • Системы LI-COR Biosciences (США) серии Odyssey позволяют одновременно и с высокой точностью детектировать как очень сильные, так и слабые сигналы. Сигналы не перекрываются и не оказывают влияния друг на друга. Вам ни когда не придется переснимать одну и ту же мембрану. Таким образом, вы экономите время, которое ранее потратили бы на проведение множественных экспозиций, с целью детекции сигналов различной интенсивности.
  • За 5-7 минут вы получаете весь набор данных (информацию обо всех возможных экспозициях образца), в то время как при работе с хемилюминесценцией только одна экспозиция может длиться от 7 до 40 минут.
  • Специальные реагенты, поставляемые компанией LI-COR Biosciences (США), позволяют легко пришить флуоресцентную метку к первичным антителам, а разрешающая способность систем серии Odyssey позволяет с высокой точностью детектировать даже очень слабый сигнал. Таким образом, вы можете сократить время на проявку Вестерн-блота вдвое, обходя стадию инкубации с вторичными антителами.
  • Процедура очистки системы крайне проста. Таким образом, вы экономите время, которое ранее потратили бы на уборку фотографической лаборатории после себя.

Краткое описание технических характеристик и функционала систем серии ODYSSEY