ПЦР: что это, принцип, преимущества, особенности

Что это такое?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в пробе, позволяющий производить ряд манипуляций с нуклеиновой кислотой: например, сращивать фрагменты, вводить мутации и т. д. Метод ПЦР используется в биологии, криминалистике, экологии, но особо распространён в медицинской практике — с его помощью диагностируют болезни, устанавливают родительство, выделяют и клонируют гены.

История открытия ПЦР

Полимеразная цепная реакция была открыта в 1985 году — именно в этот год появилась первая научная публикация в журнале Science, касающаяся использования метода на практике. Изобретение приписывается американскому биохимику Кэри Муллису и датируется 1983 годом, а в 1993 году Кэри Муллис получил за ПЦР Нобелевскую премию по химии.

Целью Муллиса была выработка методики, которая позволила бы амплифицировать ДНК при помощи ДНК-полимеразы многократными последовательными удвоениями.

Изначально ПЦР была достаточно неудобным, долгим и дорогим методом, однако в 1986 году в реакции начали использовать ДНК-полимеразу термостабильных термофильных бактерий (среди которых была, к примеру, Thermus aquaticus, из которой выделили Taq-полимеразу), способных выдерживать много циклов амплификации. После Taq-полимеразы появились Pfu-разновидности, лишённые недостатков первого типа, а сейчас в большинстве случаев используют их смесь — эти смеси быстры и точны.

Принцип полимеразной цепной реакции

ПЦР по сути — многократное копирование некоторых фрагментов ДНК, которое осуществляется в рамках температурных циклов, in vitro.

В пределах одного температурного цикла реакция происходит следующим образом: берутся два так называемых «праймера», стартовые площадки — это синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеры соответствуют участкам ДНК, и именно участок ДНК, ограниченный праймерами, будет копироваться. Далее в процесс включается полимераза, которая последовательно добавляет комплиментарные ДНК-матрице нуклеотиды. В итоге к концу ПЦР в пробирке появляются миллионы копий необходимого фрагмента.

Рабочая площадка состоит из амплификатора (термоциклера), ПЦР-бокса, микроцентрифуги, вортекса, автоматических дозаторов, системы гель-документации для исследования результатов и гель-электрофореза для их визуализации, а также расходных материалов — наконечников, штативов, пробирок.

Непосредственно цикл ПЦР выглядит так:

• денатурация — расхождение цепей ДНК, которое происходит за пару минут при температуре 95°С;
• связка праймеров с ДНК-матрицей — ещё 1–2 минуты при температуре 60°С (или другой, поскольку температура здесь определяется составом праймера);
• синтезирование цепи ДНК полимеразой — около минуты при 72°С, хотя точное время зависит от длины амплифицируемого фрагмента.

Преимущества и особенности метода ПЦР

• Высокая чувствительность — работает даже в ситуациях, когда последовательность встречается во фрагменте исключительно редко, например, один раз на более сотни клеток.
• Универсальность — методика едина практически для всех сфер и направлений и потому очень удобна и сравнительно недорога.
• Специфичность — даёт возможность выявить конкретный агент даже в присутствии многочисленных микроорганизмов, с его помощью можно проводить генотипирование.
• Возможность использовать различный биоматериал — не только биоматериалы больного, но также субстраты с молекулами — почва, вода, смывы и т. д. Поэтому ПЦР настолько эффективен в криминалистике.
• Скорость — отсутствие необходимости производить культуральную работу сокращает время от начала исследования до получения результатов до 4–5 часов.